番茄红素抑制内质网应激保护小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制

【摘要】目的：观察番茄红素对缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxgenation,H/R)小鼠心肌细胞内质网应激及内质网应激细胞凋亡的影响，探讨其发生机制，为番茄红素防治心肌缺血/再灌注损伤提供实验依据和理论基础。方法：1.新生C57BL/6小鼠原代培养心肌细胞培养48~72h，应用无血清无糖培养基在缺氧条件下培养4h，再用正常培养基分别培养1h、2h、4h、6h、8h、12h，采用CCK-8法检测心肌细胞活力，确定缺氧/复氧损伤时间，建立缺氧/复氧损伤模型。2.将心肌细胞随机分为4组：即对照组；番茄红素处理组；缺氧/复氧组；番茄红素+缺氧/复氧组；CCK-8法检测各组细胞活力，观察番茄红素的干预效应。3.采用倒置相差显微镜观察各组心肌细胞形态变化；TUNEL原位荧光染色及AnnexinⅤ/PI双染色观察各组心肌细胞凋亡情况。4.细胞内氧自由基(ROS)水平：采用DCFH-DA荧光探针标记，运用多功能荧光酶标仪、流式细胞仪及激光共聚焦显微镜检测。5.内质网应激分子：采用Real-timePCR检测细胞内GRP78、ATF6、eIF2α、uXbp-1和sXbp-1mRNA的表达。Westernblot检测心肌细胞内GRP78蛋白表达。6.内质网应激凋亡分子：采用Real-timePCR检测心肌细胞内CHOP/GADD153和caspase-12mRNA的表达。Westernblot检测细胞内CHOP/GADD153、Bax、Bcl-2、caspase-12和caspase-3的表达。7.药理干预：采用内质网应激抑制剂4-苯基丁酸(4-phenylbutyricacid,4-PBA)探讨上述缺氧/复氧损伤模型中ROS生成与内质网应激的关系，以探明番茄红素的作用位点。将心肌细胞随机分为4组：对照组，4-苯基丁酸处理组，缺氧/复氧组，4-苯基丁酸+缺氧/复氧组；采用CCK-8法和Tunel原位荧光染色分别检测各组细胞活力及细胞凋亡，运用荧光酶标仪测定各组心肌细胞内ROS水平，采用Westernblot检测GRP78，Bax、Bcl-2、CHOP/GADD153、caspase-12及caspase-3的表达。结果：1.CCK-8法检测缺氧及缺氧/复氧对细胞活力的影响：缺氧4h后细胞活力显著降低(P＜0.01)，复氧后细胞活力进一步降低，其中复氧6h时最为显著(P＜0.01)。2.倒置相差显微镜观察：原代培养48-72h小鼠心肌细胞形态正常，呈同步搏动，频率在80~100次/min之间。缺氧/复氧使心肌细胞发生皱缩，细胞数量及细胞簇明显减少，心肌细胞搏动减弱、频率减慢。番茄红素预处理可逆转这种现象。3.CCK-8法检测番茄红素对心肌细胞活力的影响：缺氧/复氧使心肌细胞活力下降到66.25±5.11%(P＜0.01)，5μmol/L番茄红素可将其细胞活力提高到80.73±6.45%(P＜0.01)。4.TUNEL法和AnnexinⅤ/PI法显示：缺氧/复氧使心肌细胞凋亡率上升到约25%，5μmol/L番茄红素可将其凋亡率降至15%左右(P＜0.01)。5.DCFH-DA荧光探针标记，荧光酶标仪、流式细胞仪和激光共聚焦扫描结果均发现：番茄红素能抑制缺氧/复氧触发ROS生成(P＜0.01)。6.内质网应激分子的检测结果显示：番茄红素能够有效抑制缺氧/复氧上调GRP78、ATF6、eIF2α、uXbp-1、sXbp-1mRNA表达，以及GRP78蛋白表达(P＜0.01)。7.内质网应激凋亡分子的检测结果发现：番茄红素可有效抑制缺氧/复氧诱导CHOP/GADD153、caspase-12mRNA表达，抑制缺氧/复氧上调CHOP/GADD153蛋白表达及Bax/Bcl-2表达比例，显著降低caspase-12和caspase-3活性片段的表达(P＜0.05)。8.药理干预显示：1mM4-苯基丁酸能够显著抑制缺氧/复氧诱导心肌细胞活力下降、凋亡增加、GRP78蛋白表达上调(P＜0.01)，抑制缺氧/复氧上调CHOP/GADD153蛋白表达及Bax/Bcl-2表达比例(P＜0.01)，降低caspase-12和caspase-3活性片段的表达(P＜0.01)，对缺氧/复氧触发ROS生成无显著影响(P＞0.05)。结论：1.番茄红素对小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用是通过降低细胞内ROS水平，抑制内质网应激，从而增强细胞活力，抑制凋亡发生。2.在本缺氧/复氧损伤模型中，内质网是ROS的下游靶点，1mM内质网应激抑制剂4-苯基丁酸能有效抑制内质网应激及内质网应激细胞凋亡，却不能有效降低细胞内ROS水平。
【作者】徐继前；
【导师】陈斌；
【作者基本信息】川北医学院，麻醉学，2014，硕士
【关键词】番茄红素；缺氧/复氧；氧自由基；内质网应激；凋亡；4-苯基丁酸；

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